工程师学习篇共聚焦显微镜的使用和管理

在生命科学研发中， 共聚焦显微技术已经成为生物医学中一个标准的研究工具。目前共聚焦显微镜的功能非常多，好像是一个科研工作站，其应用也大多在生命科学研究领域。围作为大型贵重精密w88，LSCM的日常使用的管理需要按照严格的规程来实施，LEICATCSSP5共聚焦显微镜的使用及管理方法如下。

共聚焦显微镜细胞爬片制备流程：载玻片，盖玻片一定要选择质量好，光洁，无杂质的。重要实验，需要提前检查载玻片，盖玻片的光学特性，确保无荧光干扰。盖玻片的厚度应小于O.17ram，使用前需要用玻璃洗液浸泡处理一天以上，铬酸浸泡过夜，去离子水冲洗掉残存的洗液后，无水乙醇中浸泡待用。临用前在酒精灯上过火灭菌处理后，放置在细胞培养皿中。

一、共聚焦显微镜w88的组成

人员必须经过培训，了解w88组成，工作原理和操作规范方可上机。

1、w88的组成

LEICATCSSP5主要由四部分组成：（1）显微镜光学系统。为倒置显微镜；镜头包括共聚焦专用平场复消色差10X，20×，40X， 63（油镜），100X（油镜）镜头；（2）扫描装置；（3）激光光源。本机器包含4个激光器：405nm激光，氩离子激光（457，476，488和514nm）， 56lnm激光，氦氖633nm激光，共四个检测通道；（4）检测系统。整套w88由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活进行。由于激光器在工作时散发大量的热，需要风扇降温，突然断电可能烧坏激光器，因此还需要配备稳压电源和不间断供电装备。

2、工作原理

LSCM的工作原理是：照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，激光光源经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本内焦平面上的每一点进行扫描。然后，激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，在这光路中，焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的，不能通过小孔，只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔被观测到。

二、共聚焦显微镜操作基本步骤

（1）打开稳压电源。

（2）依次打开电脑桌右侧电脑显微镜，扫描器，激光电源开关，将激光开关钥匙顺时针旋转9O。至"On—l"位置。（各按钮间隔时间15s以上）。

（3）打开显微镜电源及荧光电源。

（4）启动徕卡共聚焦软件"LASAF"。

（5）选择合适的物镜，视野。

（6）"TL/IL"功能键在明视场和荧光之间切换，通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块，进行样品的荧光观察。

（7）工具栏下方Configuration>；Laser，根据染料的激发波长，选择所需激光。

（8）点击"Aquire"进行光路设置，可改变所选激光，调节激光输出功率，改变分光镜，改变所选PMT，调节PMT检测范围，调节PMT的gain或offset。

（9）单击"AdditionalChannels"以显示透射光检测器（"PMTTrans"），选择观察方法（BF，DIC等）。

（10）在"Acquire"菜单栏的"Acquisition" 中选择扫描模式（"AcquisitionMode"），默认模式为xyz扫描，是最常用的扫描模式，可用于xy扫描和z轴层切（xyz扫描）。还可按样品扫描需要在下拉菜单中选择由X，Y，z，t（时间）以及（波长）组合而成的多维扫描模式，~Nxzy，xyt，xy，xyzt，xyz入，xyzt等。

（11）在"Acquire"菜单栏的"Acquisition"中设置扫描参数，包括分辨率，扫描速度，针孔大小，线平均，面平均，累加及放大倍数等。

（12）预览图像并优化参数。点击"Live"以设定的扫描参数预览图像，图像将显示在右侧的显示屏上。调节Z轴位置找到最适合观察的焦平面，并调节PMT的电压及偏移，或激光输出功率使图像达到最佳。可通过控制面板上相应旋钮调节以上参数。需注意参数对图像质量的正面和负面影响。

（13）采集图像并保存。单击"Capture Image"采集图像，注意：从获取第一张图片后就要开始保存，以后每获取一张图片都要保存一次，以免数据丢失。

（14）关闭显微镜汞灯电源。若使用过油镜，需用清洁液或无水乙醇清洁镜头。

（15）关闭LASAF软件，将激光开关钥匙逆时针旋转9O。至"On-0"位置，依次关闭扫描器电源，电脑，显微镜电源。

（16）风扇停止后（关闭激光开关钥匙约15min后），关闭激光电源按钮。记录关机时间，w88状况等信息。