在生命科学研发中, 共聚焦显微技术已经成为生物医学中一个标准的研究工具。目前共聚焦显微镜的功能非常多,好像是一个科研工作站,其应用也大多在生命科学研究领域。围作为大型贵重精密w88,LSCM的日常使用的管理需要按照严格的规程来实施,LEICATCSSP5共聚焦显微镜的使用及管理方法如下。
共聚焦显微镜细胞爬片制备流程:载玻片,盖玻片一定要选择质量好,光洁,无杂质的。重要实验,需要提前检查载玻片,盖玻片的光学特性,确保无荧光干扰。盖玻片的厚度应小于O.17ram,使用前需要用玻璃洗液浸泡处理一天以上,铬酸浸泡过夜,去离子水冲洗掉残存的洗液后,无水乙醇中浸泡待用。临用前在酒精灯上过火灭菌处理后,放置在细胞培养皿中。
一、共聚焦显微镜w88的组成
人员必须经过培训,了解w88组成,工作原理和操作规范方可上机。
1、w88的组成
LEICATCSSP5主要由四部分组成:(1)显微镜光学系统。为倒置显微镜;镜头包括共聚焦专用平场复消色差10X,20×,40X, 63(油镜),100X(油镜)镜头;(2)扫描装置;(3)激光光源。本机器包含4个激光器:405nm激光,氩离子激光(457,476,488和514nm), 56lnm激光,氦氖633nm激光,共四个检测通道;(4)检测系统。整套w88由计算机控制,各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活进行。由于激光器在工作时散发大量的热,需要风扇降温,突然断电可能烧坏激光器,因此还需要配备稳压电源和不间断供电装备。
2、工作原理
LSCM的工作原理是:照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,激光光源经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本内焦平面上的每一点进行扫描。然后,激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管(PMT)探测收集,并将信号输送到计算机,在这光路中,焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的,不能通过小孔,只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔被观测到。
二、共聚焦显微镜操作基本步骤
(1)打开稳压电源。
(2)依次打开电脑桌右侧电脑显微镜,扫描器,激光电源开关,将激光开关钥匙顺时针旋转9O。至"On—l"位置。(各按钮间隔时间15s以上)。
(3)打开显微镜电源及荧光电源。
(4)启动徕卡共聚焦软件"LASAF"。
(5)选择合适的物镜,视野。
(6)"TL/IL"功能键在明视场和荧光之间切换,通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块,进行样品的荧光观察。
(7)工具栏下方Configuration>;Laser,根据染料的激发波长,选择所需激光。
(8)点击"Aquire"进行光路设置,可改变所选激光,调节激光输出功率,改变分光镜,改变所选PMT,调节PMT检测范围,调节PMT的gain或offset。
(9)单击"AdditionalChannels"以显示透射光检测器("PMTTrans"),选择观察方法(BF,DIC等)。
(10)在"Acquire"菜单栏的"Acquisition" 中选择扫描模式("AcquisitionMode"),默认模式为xyz扫描,是最常用的扫描模式,可用于xy扫描和z轴层切(xyz扫描)。还可按样品扫描需要在下拉菜单中选择由X,Y,z,t(时间)以及(波长)组合而成的多维扫描模式,~Nxzy,xyt,xy,xyzt,xyz入,xyzt等。
(11)在"Acquire"菜单栏的"Acquisition"中设置扫描参数,包括分辨率,扫描速度,针孔大小,线平均,面平均,累加及放大倍数等。
(12)预览图像并优化参数。点击"Live"以设定的扫描参数预览图像,图像将显示在右侧的显示屏上。调节Z轴位置找到最适合观察的焦平面,并调节PMT的电压及偏移,或激光输出功率使图像达到最佳。可通过控制面板上相应旋钮调节以上参数。需注意参数对图像质量的正面和负面影响。
(13)采集图像并保存。单击"Capture Image"采集图像,注意:从获取第一张图片后就要开始保存,以后每获取一张图片都要保存一次,以免数据丢失。
(14)关闭显微镜汞灯电源。若使用过油镜,需用清洁液或无水乙醇清洁镜头。
(15)关闭LASAF软件,将激光开关钥匙逆时针旋转9O。至"On-0"位置,依次关闭扫描器电源,电脑,显微镜电源。
(16)风扇停止后(关闭激光开关钥匙约15min后),关闭激光电源按钮。记录关机时间,w88状况等信息。