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细胞凋亡试剂盒的应用!百欧博伟生物

2021-07-01作者:百欧博伟生物浏览次数:78  来源:北京百欧博伟生物技术有限公司

细胞凋亡试剂盒的应用!百欧博伟生物


一、背景


细胞凋亡试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针,来检测细胞早期凋亡的发生。


其检测原理为:在正常的活细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在早期凋亡的细胞中,PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合,可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。


另外,试剂盒中还提供了碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI是一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此,将Annexin V与PI联合使用时,PI则被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。


胞凋亡(apoptosis)是研究最多的程序性细胞死亡,是一个主动、高度有序、一系列酶参与的过程。细胞凋亡在保证多细胞生命体健康的过程中扮演着关键角色,对个体正常发育具有重要作用,近年来成为生物学领域中的最热课题之一。


Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸(PS)高亲和力特异性结合。在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。用标记了荧光素的Annexin V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。


二、应用


用于奶牛酮病氧化应激致肝细胞凋亡的信号转导机制研究:


体外培养奶牛肝细胞,添加BHBA(0、0.3、1.2、2.4、4.8mM)培养12、24、36h后,应用ELISA和qRT-PCR等分子生物学方法,检测奶牛肝细胞氧化应激状态相关指标GSH-Px、CAT、SOD的活性和mRNA表达水平、H2O2和MDA含量、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)、抑制羟自由基能力。


结果表明,高浓度BHBA能够降低肝细胞抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性和mRNA表达水平,同时降低肝细胞中TAC和抑制羟自由基能力,升高氧化指标H2O2和MDA的水平。


表明高BHBA可引起肝细胞氧化应激。BHBA通过线粒体依赖的ROS-JNK/ERK通路诱导肝细胞凋亡。


在牛肝细胞培养介质中添加BHBA可诱导肝细胞发生氧化应激,ROS含量增加,从而促进c-Jun N端激酶(C-JunNH(2)-terminal kinase,JNK)活化,抑制细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulatedprotein kinase,ERK)的活化,促进抑癌基因p53的转录和表达,抑制NF E2相关因子2(NF-E2-related factor2,Nrf2)的转录和表达,上调促凋亡基因Bcl2相关蛋白X(Bcl-2-associated X protein,Bax)和Bcl-xL/Bcl-2相关死亡启动子(Bcl-xl/Bcl-2-associated deathpromoter,Bad)的表达,下调抗凋亡基因B细胞淋巴结基因2(B-cell lymphonma gene2,Bcl-2)、Bcl-w和B细胞淋巴结extra large(B-cell lymphoma-extra large,Bcl-xl)的表达,进而引起线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)下降,使细胞色素C(Cytochrome c,cytc)和凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factor,AIF)释放,激活半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)和多腺苷二磷酸多聚酶(PolyADP-ribose polymerase,PARP)。


表明BHBA可以通过线粒体介导的ROS-JNK/ERK信号通路,促进肝细胞凋亡基因表达,抑制抗凋亡基因表达,造成肝细胞凋亡。


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