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STBL3超级感受态细胞的应用!

2021-07-14作者:百欧博伟生物浏览次数:580  来源:北京百欧博伟生物技术有限公司

STBL3超级感受态细胞的应用!


一、背景


STBL3超级感受态细胞是为专为克隆慢病毒表达载体系统里顺向重复序列而设计的。该菌株可以降低慢病毒和其它反转录病毒长片段末端重复区意外重组的频率。这种特性是TOP10菌株没有的。与此同时,Stbl3™比SURE®细胞更稳定,能提高慢病毒载体的克隆效率。


Stbl3超级感受态细胞是操作慢病毒系统推荐使用的菌株,对慢病毒载体等较大的质粒转化的效果好,能有效减低错误重组的可能性。


二、操作方法


1、Stbl3感受态细胞-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打),冰中静置25分钟。


2、42℃水浴热激45秒,迅速放回冰上并静置2分钟,晃动会降低转化效率。


3、向离心管中加入0.9 mL室温S.O.C.或LB培养基(S.O.C.营养丰富,可提高转化效率)。


4、37℃,225 rpm复苏60分钟或30℃,225 rpm复苏90分钟。

(当质粒中含有不稳定片段时,30℃培养可降低错误重组的概率,若转化control pUC19计算转化效率,则需37℃,225 rpm复苏60分钟)


5、5000rpm离心一分钟收菌,留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的S.O.C.或LB培养基上。


6、将平板倒置放于37℃或30℃培养箱过夜培养。


三、应用


用于E.coli高效感受态细胞转化体系的建立及诱导型瞬时表达载体的构建研究:


比较了不同方法制备的大肠杆菌感受态细胞的转化效率,并优化了质粒DNA转化感受态细胞的转化体系。


结果表明,应用高效法制备的感受态细胞其转化效率极显著高于普通大肠杆菌感受态细胞,转化效率提高了966.1%。-80℃超低温长期保存时,以7%DMSO为冻存保护剂保存的感受态细胞其转化效率最高,达到1、1×107,较15%甘油冻存保护剂保存的转化效率提高了69%。温浴5 min,冰浴10 min时,其转化效率最高,达到4.95×107。并且转化时间缩短至普通大肠杆菌感受态细胞的12.5%,仅为15 min。


2、试验以拟南芥为试材,设计特异引物克隆得到了拟南芥诱导型启动子rd29A的基因序列,通过在GenBank上进行核苷酸序列的比对,分析了该启动子的各个响应元件。结果表示,序列的第370-375碱基之间有5 bp的TATA盒(TATAA),在第737-744碱基间有8 bp的戴帽信号序列(TCAGTCTC),在第302-305和353-356碱基间有CAAT盒和富GC区域(ATGGGCCAATAG)。干旱响应顺式作用元件(DRE)(TACCGACAAT)这段序列位于第556-565碱基之间,而报道中的ABA响应元件(ABRE)(ACGTG)则位于第719-724碱基之间。


3、试验构建了诱导型植物瞬时表达载体PBI221-rd29A。通过分析启动子的酶切位点,试验利用HindIII和XbaI对启动子基因片段进行双酶切处理,同时载体PBI221也用相同的限制性内切酶进行酶切处理,将处理产物在T4 DNA连接酶的作用下16℃进行过夜连接,其产物转化大肠杆菌感受态细胞,经过培养得到含有载体质粒的克隆子。提取所构建载体的质粒进行酶切检测,顺利释放800bp左右目的条带,证明载体构建成功。


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