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永生化人脑微血管内皮细胞的培养步骤!

2021-07-19作者:百欧博伟生物浏览次数:912  来源:北京百欧博伟生物技术有限公司

永生化人脑微血管内皮细胞的培养步骤!


一、基本信息

规格:1*10 6

拉丁属名:HCMEC/D3(永生化人脑微血管内皮细胞)

细胞名称:永生化人脑微血管内皮细胞

细胞用途:仅供科研使用。

注意事项:仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的,不可用于人类或动物的临床诊断或治疗,非药用,非食用。


二、细胞介绍

人脑微血管内皮细胞是人微血管内皮细胞通过含端粒酶逆转录SV40T慢病毒转染得到。


三、细胞特性

1)来源:人脑微血管

2)形态:细胞呈梭状,细长型

3)含量:>1x106 个/mL

4)污染:支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

5)规格:T25瓶或者1mL冻存管包装


四、细胞的运输和保存

可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式

1)干冰运输,收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏;

2)存活细胞,收到后应继续生长,传代达到细胞生长状态良好时,再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

3)收到细胞后请拍照,3天内如果发现污染,请及时拍照与我们联系。


五、注意事项

1、收到细胞后,若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染,请立即与我们联系。

2、收到细胞先不开瓶盖,瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置2-4小时(视细胞密度而定)稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对细胞进行不同倍数拍照(建议收细胞时就整体外观拍一张照片,观察培养基的颜色和是否有漏液情况,随后在显微镜下拍下细胞状态,100*,200*各一张),观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行销售依据。

3、由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素影响,故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态,故客户需要售后时需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后客服人员沟通的时间证明,期间间隔时间不能大于7天。

4、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性,必须在二级生物安全台内操作,并请注意防护,所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。


六、细胞接收后的处理方法

1)收到细胞后,请检查发货培养瓶的状况,若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染,请拍照后及时联系我们。

2)在显微镜下确认细胞生长状态时,zui hao在低倍镜(4或5X物镜)下进行,能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X和20×物镜下,同时给刚收到的细胞拍照,(10×,20×)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存,作为细胞需要售后时提供收到细胞时细胞状态的依据。

3)观察好细胞状态后,75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

4)贴壁细胞:在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象,如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长,可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h,然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟,弃去上清重悬后接种到加有按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基的原培养瓶中(或新的培养瓶中)。

5)悬浮细胞:T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h,然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟,弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中(加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基)。

6)备注:运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞,请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后di yi次传代建议1:2传代。


七、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备:

1)准备内皮细胞专用基础培养基;优质胎牛血清,5%;添加对应因子1%;双抗,1%。

2)培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存细胞:冻存细胞时,用FBS重悬细胞,然后加入一定量的DMSO,轻轻混合均匀后移入到冻存管中,DMSO终浓度为10%。

2、细胞处理:

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,离心管加入4mL培养基混合均匀。在800-1000RPM条件下离心4-5分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入T25培养瓶中培养,补加培养基至6ml。

2)细胞传代:如果细胞密度达80%,即可进行传代培养。

3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。


对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:

1、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加入3-4ml此细胞的培养基终止消化。

3、轻轻吹打后吸出,移入15ml离心管中,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养液后吹匀。

4、收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1:2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中,建议冻存一支备用,后续传代根据实际情况按1:2到1:4的比例进行。


下面T25瓶为类;

1、细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗一遍后加入1-2ml胰酶(含EDTA),细胞变圆脱落后,加入2-3ml含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。

2、4min 1000rpm 离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞,根据细胞数量加入血清和等体积的冻存液,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低于1x10E6/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,注意冻存管做好标识。

3、将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。


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